Eksperimento principas
Hemoglobino elektroforezės tikslas – nustatyti ir patvirtinti įvairius normalius ir nenormalius hemoglobinus.
Dėl skirtingų hemoglobino tipų skirtingų krūvių ir izoelektrinių taškų tam tikrame pH buferiniame tirpale, kai hemoglobino izoelektrinis taškas yra žemesnis už buferinio tirpalo pH, hemoglobinas neša neigiamą krūvį ir elektroforezės metu migruoja link anodo. Ir atvirkščiai, teigiamą krūvį turintis hemoglobinas juda katodo link.
Esant tam tikrai įtampai ir praėjus tam tikram elektroforezės laikui, skirtingų krūvių ir molekulinės masės hemoglobinai turi skirtingą migracijos kryptį ir greitį. Tai leidžia atskirti skirtingas zonas, o tose zonose gali būti atliekama kolorimetrinė arba elektroforetinė skenavimo analizė, siekiant kiekybiškai įvertinti įvairius hemoglobinus. Dažniausiai naudojamas metodas yra pH 8,6 celiuliozės acetato membranos elektroforezė.
Citoplazmoje etilenglikolio grupės (CHOH-CHOH), esančios glikogeno arba polisacharidinėse medžiagose (pavyzdžiui, mukopolisacharidai, mukoproteinai, glikoproteinai, glikolipidai ir kt.), oksiduojamos periodine rūgštimi ir paverčiamos aldehido grupėmis (CHO-CHO). Šios aldehidų grupės susijungia su bespalviu purpuriškai raudonu Schiff reagentu, sudarydamos purpuriškai raudoną dažą, kuris nusėda ten, kur ląstelėje yra polisacharidų. Ši reakcija žinoma kaip dažymas periodine rūgštimi-Schiff (PAS), anksčiau vadinamas glikogeno dažymu.
Eksperimento metodas
Medžiagos:Celiuliozės acetatasmembranas, elektroforezės aparatai(DYCP-38C ir maitinimo šaltinis DYY-6C), Superior Sample Loading Tool (pipete), spektrofotometras, kolorimetrinės kiuvetės, buferiai.
Buferis:
(1) pH 8,6 TEB buferis: pasverkite 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g boro rūgšties ir įpilkite distiliuoto vandens iki 1000 ml.
(2) Boratinis buferis: pasverkite 6,87 g borakso ir 5,56 g boro rūgšties ir įpilkite distiliuoto vandens iki 1000 ml.
Procedūra:
Phemoglobino tirpalo taisymas
Paimkite 3 ml kraujo, kuriame yra heparino arba natrio citrato kaip antikoaguliantų. Centrifuguokite 2000 aps./min. greičiu 10 minučių ir išmeskite plazmą. Raudonuosius kraujo kūnelius tris kartus nuplaukite fiziologiniu tirpalu (750 aps./min., kiekvieną kartą centrifuguojant 5 minutes). Centrifuguokite 2200 aps./min. greičiu 10 minučių ir išmeskite supernatantą. Įpilkite tokio paties kiekio distiliuoto vandens, tada įpilkite 0,5 karto tūrio anglies tetrachlorido. 5 minutes stipriai kratykite, tada 10 minučių centrifuguokite 2200 aps./min., kad surinktumėte viršutinį Hb tirpalą vėlesniam naudojimui.
Membranos mirkymas
Celiuliozės acetato membraną supjaustykite 3 cm × 8 cm dydžio juostelėmis. Mirkykite juos pH 8,6 TEB buferyje, kol jie bus visiškai prisotinti, tada išimkite ir nusausinkite filtravimo popieriumi.
Pastebėjimas
Pipete ant celiuliozės acetato membranos (šiurkščios pusės), maždaug 1,5 cm nuo krašto vertikaliai užtepkite 10 μl hemoglobino tirpalo.
Elektroforezė
Supilkite borato buferinį tirpalą į elektroforezės kamerą. Įdėkite celiuliozės acetato membraną dėmėtąja puse prie kameros katodo galo. Įjunkite 200 V įtampą 30 minučių.
Eliucija
Iškirpkite HbA ir HbA2 zonas, sudėkite jas į atskirus mėgintuvėlius ir įpilkite atitinkamai 15 ml ir 3 ml distiliuoto vandens. Švelniai pakratykite, kad hemoglobinas visiškai išsiskirtų, tada sumaišykite.
Kolorimetrija
Sumažinkite absorbciją, naudodami distiliuotą vandenį eliuavimo tirpalui, ir išmatuokite absorbciją esant 415 nm.
Skaičiavimas
HbA2 (%) = HbA2 mėgintuvėlio sugertis / (HbA mėgintuvėlio absorbcija × 5 + HbA2 mėgintuvėlio sugertis) × 100 %
Eksperimento rezultatų apskaičiavimas
Etaloninis pH 8,6 TEB buferio celiuliozės acetato elektroforezės diapazonas: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Pastabos
Elektroforezės laikas neturėtų būti per ilgas. Elektroforezės metu celiuliozės acetato membrana neturi išdžiūti. Nutraukite elektroforezę, kai HbA ir HbA2 yra aiškiai atskirti. Ilgalaikė elektroforezė gali sukelti juostų difuziją ir susiliejimą.
Venkite naudoti per daug mėginio. Per didelis hemoglobino kiekis gali lemti juostos atsiskyrimą arba nepakankamą dažymąsi, dėl ko gali būti klaidingai padidėjęs HbA kiekis.
Neleiskite celiuliozės acetato membranos užteršti baltymais.
Srovė neturėtų būti per didelė; kitaip hemoglobino juostos gali neatsiskirti.
Visada kaip kontrolinę medžiagą įtraukite normalių asmenų mėginius ir būtinus žinomus nenormalius hemoglobinus.
Beijing Liuyi Biotechnology gamina profesionalų elektroforezės baką hemoglobino elektroforezei, kuris yra modelisDYCP-38Cceliuliozės acetato membranos elektroforezės bakas, ir yra du elektroforezės maitinimo šaltinio modeliai, skirti celiuliozės acetato membranos elektroforezės bakuiDYY-2CirDYY-6Cmaitinimo šaltinis.
Tuo tarpu Beijing Liuyi Biotechnology klientams teikia celiuliozės acetato membraną, o celiuliozės acetato membranos dydį galima pritaikyti. Kviečiame paprašyti mūsų pavyzdžių ir daugiau informacijos.
„Beijing Liuyi“ prekės ženklas turi daugiau nei 50 metų istoriją Kinijoje ir įmonė gali tiekti stabilius ir aukštos kokybės produktus visame pasaulyje. Ilgus metus vystantis, vertas jūsų pasirinkimo!
Dabar ieškome partnerių, laukiame tiek OEM elektroforezės bako, tiek platintojų.
Jei turite kokių nors mūsų produktų pirkimo planų, nedvejodami susisiekite su mumis. Galite atsiųsti mums žinutę el[apsaugotas el. paštas]arba[apsaugotas el. paštas], arba skambinkite mums +86 15810650221 arba pridėkite Whatsapp +86 15810650221 arba Wechat: 15810650221
Paskelbimo laikas: 2023-09-20